الموسوعة العربية

بحث متقدم

أ ب ت ث ج ح خ د ذ ر ز س ش ص ض ط ظ ع غ ف ق ك ل م ن هـ و ي

التأشيب

تاشيب

Recombination -

التأشيب

التأشيب المماثل homologous recombination

تقانة الدنا المأشوب recombinant DNA technology وتطبيقاتها

مجد الجمالي

يمكن تعريف تأشيب الدنا DNA recombination (أو إعادة الارتباط) ببساطة بأنه تشكيل جزيء جديد من الـدنا DNA بعد دمج جزيئتين منه تمتلكان على الأغلب نسبة عالية من تشابه التسلسل النكليوتيدي. ويؤدي التأشيب الطبيعي natural recombination دوراً مهماً في إغناء التكوين الجيني للذراري الناتجة من التكاثر الجنسي، إذ يجري تبادل قطع من الصبغيات القرينة أو المماثلة homologous chromosomes في أثناء الانقسام المنصّف meiosis وإنتاج الأعراس الذكرية والأنثوية. كما يؤدي أيضاً دوراً في توليد جينات (مورثات) جديدة وفي إصلاح الدنا DNA repair -ولا سيّما إصلاح الكسر الثنائي السلسلة (الطاق) Double-Stranded Breaks (DSBs) - وفي ملء الفراغات التي قد تتولد في أثناء تضاعف الدنا، وتؤدي إلى لجم شوكة التضاعف replication fork. ونتيجة المعرفة التي تراكمت في العقود الماضية حول آليات التأشيب الطبيعية تمكّن العلماء من محاكاة تلك الآليات لإنتاج خلايا مأشوبة محوّرة جينياً عبر إدراج جينات غيرية في صبغياتها.

هناك أربعة أنماط من التأشيب الطبيعي في الكائنات الحية:

1- التأشيب المماثل homologous الذي يجري بين جزيئات من الدنا ذات نسبة عالية من التشابه بين تسلسلاتها النكليوتيدية، مثل الصبغيات القرينة في الكائنات الثنائية الصيغة الصبغية diploid.

2- التأشيب غير المماثل non-homologous: يجري في مناطق ليس فيها تشابه كبير في التتاليات مثل الانتقالات (الإزفاءات) translocations بين صبغيات مختلفة أو الخَبْن (الحذوفات) deletions التي تزيل جينات عدة من الصبغي، مع وجود تشابه في منطقة صغيرة من الصبغي في بعض الحالات، كالتشابه الحاصل بين جينين يبعد بعضهما عن بعض ملايين النكليوتيدات.

3- التأشيب النوعيّ الموقع :site-specific يكون بين تتاليات متشابهة قصيرة جداً موجودة على جزيئات دنا مختلفة (نحو 12- 24 نكليوتيداً)، ويتطلب هذا النوع آليات إنزيمية خاصة بكل موقع مثل انغراس integration بعض فيروسات عاثيات البكتريا bacteriophages في صبغيات البكتريا وإعادة ترتيب جينات الغلوبولينات المناعية في الفقاريات.

4- التأشيب التضاعفي replicative الذي يعطي نسخة جديدة لقطعة من الدنا، ومثالها العناصر المنتقلة أو الينقولات transposons؛ إذ تستخدم بعض عناصر الينقولات آلية للتأشيب التضاعفي لتوليد نسخة جديدة من الينقول في موقع جديد من الدنا. وسيُركَّز في بعض تفاصيل التأشيب المماثل لكونه الأكثر تواتراً والأعمق دراسةً، مع الإشارة إلى أن كثيراً من الآليات التي تحكم أنماط التأشيب الأخرى ما تزال غامضةً حتى اليوم.

التأشيب المماثل homologous recombination:

إن أحد أهم الأمثلة على التأشيب المماثل هو تبادل القطع الجينية بين الصبغيات القرينة والمتضاعفة حديثاً خلال عملية الانقسام المنصِّف في الكائنات ذات الصيغة الصبغية المضاعفة. ويضمن التأشيب المماثل أن كلاً من الأعراس gametes الناتجة تتضمّن معلومات مشتقة من كلا الأبوين، وأن الذرية الناتجة من الإخصاب ستكتسب جينات من أجدادها الأربعة، وتنال بذلك حداً مقبولاً من التنوع الجيني. ويحصل هذا النوع من التأشيب المماثل خلال الطور الأول prophase I من الانقسام المنصِّف الأول؛ إذ يحدث تشابكٌ synapsis بين الكروماتيدين غير الأخوين non-sister chromatids للصبغيين القرينين، تتقارب من خلاله التتاليات المتماثلة بين الكروماتيدات، وتبدأ عملية التأشيب المماثل لتنتهي بعبور crossing over قطع من صبغي الأب إلى صبغي الأم القرين وبالعكس، وينتج من ذلك بعض الصبغيات المأشوبة recombinant chromosomes إضافةً إلى صبغيات أخرى غير مأشوبة لم يحصل فيها العبور (الشكل1). وعلى الرغم من كونها شائعةً؛ فإن عملية التأشيب المماثل ذات درجة كبيرة من التعقيد، وتضم عدة مراحل تبدأ بارتصاف سلسلتي DNA متماثلتين أو متشابهتين لدرجة كبيرة، ومن ثمّ قطع دقيق لكلٍّ من السلسلتين، وتبادل بينهما، وأخيراً إتمام sealing الجزيـئات المأشوبة الناتجة ولحمها.

الشكل (1) تشكّل الصبغيات المأشوبة خلال الطور الأول من الانقسام المنصّف؛ إذ تنتقل قطع من أحد الصبغيات إلى قرينه وتنتج بعض الصبغيات المأشوبة التي تحمل معلومات جينية متغايرة عن الصبغي الأصلي.

يحدث التأشيب المماثل بدرجة عالية من الدقة وبتواتر عالٍ في كل من حقيقيات النوى وطلائعياتها. وعلى الرغم من أن البكتريا لا تخضع للانقسام المنصِّف؛ فإنها تنخرط في نمط من التكاثر الجنسي المسمى بالاقتران conjugation الذي تنتقل المعلومات الجينية من خلاله من بكتريا إلى أخرى على شكل قطع من الدنا التي يمكن أن تنغرس في صبغي الخلية المضيفة؛ ليتحول بذلك هذا الأخير إلى صبغي مأشوب. وكما هو مبيّن بالشكل (2) فإن التسلسلات المتماثلة بين قطعتي الدنا هي التي تتواسط عملية انغراس قطعة الدنا في الصبغي المضيف؛ في حين تنغرس التتاليات الغيرية غير المتماثلة الواقعة بينها تلقائياً ومن دون أن تتدخل في آلية التأشيب. وتتبادل عن هذا الطريق الخلايا البكترية كثيراً من المعلومات الجينية التي قد تكتسب من خلالها صفات اصطفائية كمقاومة الصادات الحيوية أو التلاؤم مع البيئة المحيطة بالخلايا.

الشكل (2) يبيّن انغراس قطعة دخيلة من الدنا في صبغي الخلية المضيفة بوساطة تبادل جزء من التتاليات المتماثلة بين جزيئتي الدنا ينجم عنه صبغي مأشوب يحمل بعض المعلومات الوراثية الجديدة (الجينات المتضمّنة بالقطعة الخضراء).

ويمكن أن تحصل الخطوات الأساسية للتأشيب في حقيقيات النوى وطلائعياتها من خلال طريقين اثنين، تبعاً لكون كسر جزيء الدنا DNA break قد جرى في سلسلة واحدة أو في كلتا السلسلتين؛ ففي الحالة الأولى ولاحقاً لتراصف الصبغيات القرينة في حقيقيات النوى ذات الصيغة المضاعفة يجري إنتاج كسر في إحدى سلسلتي كلٍّ من الصبيغيَّين غير القرينين؛ ممّا يترك نهايتين حرّتين في جزيئتي الدنا. وتعبر كلٌّ من النهايتين، وتغزو الكروماتيد الآخر غير القرين مشكّلةً بنية تسمى موصل هوليداي Holliday junction (الشكل3). وتحدث الخطوة التالية التي تدعى هجرة الفرع branch migration مع هجرة موصل هوليداي ومسيره على طول قطعة الدنا. بعد ذلك يجري إنهاء الموصل إما أفقياً - الأمر الذي لا ينتج منه تأشيب - وإما عمودياً، والذي يؤدي إلى عبور قطعة من الدنا بين الصبيغيِّين غير القرينين اللذين يصبحان الآن صبغيّين مأشوبين. أما في حال حصل كسر الدنا في كلتا السلسلتين أو كسر ثنائي السلسلة، فتتحول عندها نهاية الكسر إلى طاق أحادي بإضافة ذيول على النهاية إلى أحد الطاقين، ويمكن لهذه النهايات أن تقوم بغزو سلسلة المرصاف المقابل؛ مما ينجم عنه مَوْصِل هوليداي. ولاحقاً لهذه النقطة يجري إنهاء العملية على نحوٍ مشابه لكسر السلسلة الواحدة المذكور سابقاً.

الشكل (3) مراحل تأشيب الدنا في الصبغيات القرينة (أو قطع الدنا الأخرى ذات التماثل الكبير في التتاليات النكليوتيدية). ويظهر من الشكل معالجة الكسر الثنائي السلسلة DSB وتشكّل ذيول أحادية السلسلة تعتمد على السلسلة المرصاف المماثل في رصف التتاليات النكليوتيدية المحذوفة وإتمام السلسلة المكسورة وتشكيل موصل هوليداي، ومن ثمِّ إنهاء الموصل وإتمام عملية التأشيب التي ينجم عنها صبغيان مأشوبان. وتظهر في الشكل صورة بالمجهر الإلكتروني لموصل هوليداي يتوضح فيها تشابك الصبغيات القرينة عند الموصل.

وبصرف النظر عن كون الكسر أحادي السلسلة أو ثنائيّها؛ فإن عدداً من الإنزيمات يكون ضرورياً لتوسط خطوات التأشيب. وقد حُدِّدت الجينات المسؤولة عن هذه الإنزيمات بداية في بكتريا الإشريكية القولونية E. coli عبر عزل خلايا طافرة بالتأشيب على نحو كبير. وكشفت نتائج الأبحاث أن جيناً يدعى recA في بكتريا E. coli يشفّر بروتيناً ضرورياً لغزو السلسلة؛ في حين تشفّر الجينات recB وrecC وrecD ببتيدات ثلاثية ينضم بعضها إلى بعض؛ لتشكل معقداً بروتينياً، يعرف بـ RecBCD، يمتلك القدرة على فك ارتباط سلسلتي الدنا وشطرهما. وهناك جينان هما ruvA و ruvB يشفّران إنزيمات تحفّز هجرة الفرع؛ في حين يجري إنهاء بنى موصلات هوليداي بوساطة إنزيم يدعى ريزولفاز resolvase الناتج من تعبير الجين ruvC. وإضافةً إلى ذلك فإنّ الإنزيمات التي تكتنف تضاعف الدنا- مثل الليغاز وبوليمراز الدنا- تشارك أيضاً في عملية التأشيب.

أُميط اللثام في حقيقيات النوى عن آليات مماثلة لما سبق نتيجة جهد حثيث للكثير من الباحثين الذين درسوا عملية التأشيب بصورة معمّقة في خميرة الجعة (السُّكيراء) Saccharomyces cerevisiae؛ إذ كشفت الأبحاث عن مجموعة جينات تدعى Rad تؤدي دوراً في التأشيب المماثل، ولا سيّما الجين Rad51 الذي هو مثيلٌ لجين recA في طلائعيات النوى ويشفّر بروتين Rad51 الذي يملك فعالية مُؤَشِّبة recombinase. وتبيّن أن جين Rad51 محافظ عليه conserved بصورة كبيرة في كائنات عديدة أخرى بما في ذلك خلايا الثدييات؛ في حين قد تختلف البروتينات المساعدة في الكائنات المختلفة. وعلى سبيل المثال يبدو عند البشر أن جينات BRCA1 وBRCA2 الكابتة للورم tumor suppressor genes تؤدي دوراً مهماً في التحكم في عملية التأشيب. وأن الأشخاص الذين يملكون طفرات في أحد أليلي جين BRCA2 هم عرضة لزيادة أخطار حدوث سرطان الثدي والمبيض؛ في حين تؤدي الطفرات في كلا الأليلين إلى فقر دم فانكوني Fanconi’s anemia، وهو مرض جيني يؤهّب بقوّة لحدوث السرطان من بين عيوب كثيرة أخرى. وتبيّن حديثاً أن بروتين BRCA2 البرّي wild type يحفّز ارتباط Rad51 بسلسلة الدنا الأحادي ssDNA، ويقوم بإصلاح الدنا المتعرض للكسر.

وعلى الرغم من أن الإنزيمات والبروتينات الأخرى التي تتواسط عملية التأشيب قد كُشِفت ووُضِّحت إلى حد بعيد في حقيقيات النوى: يبقى السؤال الأهم هو كيف تُجلَب التتاليات المتماثلة بعضها مع بعض، ولا سيّما بالنسبة إلى حالات التأشيب التي تحصل في الخلايا الجسدية في أثناء إصلاح الكسر في سلسلتي الدنا، والتي لا تخضع لآليات الانقسام المنصِّف وتزاوج الصبغيات القرينة؟ وقد ظهرت فيما بعد عدة فرضيات بديلة، سُمّيت إحداها نموذج العدم null model، واقتُرِح فيها أن التتاليات المتماثلة تجد بعضها بعضاً من خلال عملية انتشار منفعلة passive diffusion يُقارن فيها تتالي الدنا عند نهاية الكسر للسلسلة بجميع النهايات المحتملة في المجين. مع العلم أنه حتى يحدث ذلك يجب أن يجري الانتشار بسرعة تفوق أربعين مرّة السرعة التي يضيف فيها إنزيم بوليمراز الدنا نكليوتيداً واحداً إلى سلسلة الدنا المتضاعفة؛ الأمر الذي يجعل هذا النموذج بعيد الاحتمال. وتقترح الفرضية البديلة أن الصبغيات المتماثلة تكون في زوج بصورة دائمة في الخلايا الجسدية. وعلى الرغم من وجود دلائل تعزز هذه الفرضية؛ فقد أثبتت بعض التجارب أن النهايات المكسورة للدنا يمكنها أن تتأشب مع مواقع منتبذة ectopic بالتواتر نفسه الذي تتأشب فيه مع الصبغيات القرينة. إضافة إلى ذلك وعلى الرغم من أن تزاوج الصبغيات القرينة يحصل في بعض الخلايا الجسدية لبعض الكائنات (مثل ذبابة الخل)؛ فلم يثبت ذلك في كائنات أخرى، بما فيها الثدييات. ومن الواضح أن الآلية الدقيقة المسؤولة عن التقاء القطع المتماثلة خلال عملية التأشيب لم تحدد بعد.

تقانة الدنا المأشوب recombinant DNA technology وتطبيقاتها:

تستخدِم تقانة الدنا المأشوب نمطين من التأشيب يختلفان عن الأنماط الأربعة المذكورة سابقاً. يختص النمط الأول بالتقطيع وإعادة التوصيل الموجَّه إلى جزيئات الدنا في الزجاج باستخدام إنزيمات التقييد restriction enzymes والإنزيمات الضَّامَّة ligases. وبعد توليدها تنقل هذه الجزيئات المأشوبة إلى كائن مضيف عادة ما يكون خلايا بكترية (الشكل 4-أ ). فإذا كان الجزيء المأشوب بلاسميداً plasmid؛ فيمكن أن يبقى خارج صبغي المضيف، أو أن ينغرس فيه؛ ليُحصل على مضيف ثابت الاستحالة stably- transformed host. ويمكّن هذا الأخير من التعبير الجيني الدائم للجينات المأشوبة المنغرسة في صبغي الخلية المضيفة؛ في حين كثيراً ما تفقد الخلية المضيفة البلاسميدات المأشوبة المستقلة عن صبغيّها في أثناء تضاعف الخلية على نحو يحذف التعبير الجيني للجينات المتضمَّنة في البلاسميد المأشوب. والنمط الثاني المستخدم هو التأشيب العشوائي random الذي يمكن بوساطته لتتالٍ معيّن أن ينغرس في صبغي المضيف عشوائياً ومستقلاً عن وجود التتاليات المتماثلة (الشكل 4 -ب). وعلى الرغم من أن آلية التأشيب العشوائي غير معروفة إلى الآن، فهي ممارسة روتينية في المخابر لإثبات استحالة الخلايا.

الشكل (4) تقانة الدنا المأشوب: أ- مراحل تأشيب جين بشري قيد البحث في بلاسميد بكتري، والتي تبدأ بقطع كلٍّ من الجين البشري المتضمَّن في المجين والبلاسميد البكتري بإنزيمات التقييد نفسها، ممّا ينجم عنه تتاليات متماثلة في نهاية قطع الدنا تسهّل انغراس الجين ضمن البلاسميد ليجري بعدها نقل البلاسميد المأشوب إلى خلية بكترية والتعبير عن البروتين المشفّر بالجين المنقول. ويظهر في الشكل احتمالان آخران لإعادة ارتباط قطعة الجين أو البلاسميد بذاتها؛ الأمر الذي لا يُتنج بلاسميداً مأشوباً، ولا يعبّر عن الجين بعد انتقاله إلى الخلية البكترية. ب - التأشيب العشوائي الذي تنغرس من خلاله قطعة من الدنا في صبغي الخلية البكترية مستقلّة عن التماثل بالتتاليات النكليوتيدية.

وقد استخدمت تقانة الدنا المأشوب في نقل العديد من الجينات البشرية للتعبير عنها في خلايا بكترية أو خطوط خلوية cell-lines للحشرات والثدييات بهدف إنتاج بروتينات بشرية مأشوبة recombinant proteins ذات تطبيقات علاجية أو صناعية أو بحثية. والأمثلة على ذلك كثيرة جداً؛ منها إنتاج هرمون الإنسولين وهرمون النمو والإرثروبيوتين المأشوبة، وكثير جداً من الإنزيمات المأشوبة ذات الاستخدام الدوائي والصناعي.

ولا بدّ من الإشارة إلى أن الكثير من الغموض ما زال يكتنف آليات التأشيب في كلٍّ من حقيقيات النوى وطلائعياتها؛ إلا أنه أمكن الاستفادة من المعرفة المتراكمة خلال العقود الماضية على نحوٍ كبير في الوصول إلى تطبيقات متعددة للتأشيب، ومن أهمها إنتاج بروتينات علاجية غيّرت مسار العلاج لكثير من الأمراض المزمنة الشائعة.

مراجع للاستزادة:

- A. Barzel and M. Kupiec, Finding a Match: How Do Homologous Sequences Get Together for Recombination?, Nature Reviews Genetics, 2008.

- JS. Filippo, P. Sung, and H. Klein, Mechanism of Eukaryotic Homologous Recombination. Annu. Rev. Biochem, 2008.

- JE. Krebs, ES. Goldstein & Kilpatrick, Homologous and Site-specific Recombination, IN: Lewin’s Genes X, Jones and Bartlett, Burlington, MA, USA, 2011.

- M. Modesti and R. Kanaar, Homologous recombination: from Model Organism to Human Disease. Genome Biology, 2001.

- P. Sung and H. Klein, Mechanism of Homologous Recombination: Mediators and Helicases Take on Regulatory Functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2006.