إنزيمات التحديد (التقييد)

بحث متقدم

أ ب ت ث ج ح خ د ذ ر ز س ش ص ض ط ظ ع غ ف ق ك ل م ن هـ و ي

إنزيمات التحديد (التقييد)

انزيمات تحديد (تقييد)

Restriction enzymes - Enzymes de restriction

إنزيمات التحديد

وفاء شومان

منشأ إنزيمات التحديد

طريقة تسمية إنزيمات التحديد

تصنيف إنزيمات التحديد وخصائصها

إنزيمات التحديد (التقييد) restriction enzymes هي مجموعة من الإنزيمات المتخصصة التي تتعرف مقاطع ذات عدد وتركيب محدد من النوكليوتيدات، وتقطع جزيء الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA ضمنها أو قربها؛ عن طريق حلمهة (هضم) الرابطة الفسفاتية ثنائية الإستر الموجودة بين مجموعة الفسفات وجزيء السكر؛ معطيةً بذلك نهايات غير قابلة للتلاصق (صادقة) blunt ends أو نهايات قابلة للتلاصق (لزجة) sticky or cohesive ends (الشكل 1).

الشكل (1) نهايات الـ DNA الناتجة من الهضم الإنزيمي.

يسمى المقطع الذي يتعرفه إنزيم التحديد بموقع التحديد، ويختلف طول المقطع النوكليوتيدي المكِّون له تبعاً لنوع الإنزيم، فمثلاً الإنزيمات Eco RI وSac I وSst I تتعرف مواقع تحديد مكوّنة من ستة أشفاع من النوكليوتيدات، في حين يتعرف Not I مقطعاً مكوناً من ثمانية أشفاع من النوكليوتيدات، ويتعرف الإنزيم Sau3AI موقعاً مؤلفاً من أربعة أشفاع منها. يتوقف عدد المرات التي يحتمل أن يقطع فيها إنزيم التحديد جزيء الـ DNA على طول مقطع موقع التحديد، حيث تتوزع هذه المقاطع على طول جزيء الـ DNA بتكرار يتناسب عكساً مع طول المقطع النوكليوتيدي المميز لها، وإن احتمال وجود موقع واحد لمقطع مكون من أربعة أشفاع من النوكليوتيدات هو مرة كل 256 شفعاً نوكليوتيدياً، أي ما يعادل (n)1/4، حيت n تمثل عدد أشفاع النوكليوتيدات المكوّنة لمقطع موقع التحديد.

منشأ إنزيمات التحديد

قام الباحثون سميث Smith وولكوكس Wilcox وكيلي Kelley عام 1968 بتوصيف أول إنزيم من إنزيمات التحديد وهو Hind II الذي استخلص من بكترياHaemophilus influenzae، وهناك حالياً نحو 900 إنزيم تحديد قيد الاستخدام في أبحاث البيولوجيا الجزيئية، تم استخلاصها من 230 سلالة بكترية، وتتعرف المئات من المقاطع النوكليوتيدية المختلفة.

تُستخلص أغلب إنزيمات التحديد من الخلايا البكترية؛ وجزء آخر منها من مجموعة من الكائنات الدقيقة وحيدة الخلية تسمى البدئيات Archaea. تمثل إنزيمات التحديد النظام الدفاعي الطبيعي للبكتريا الموجودة فيها، حيث تقوم هذه الإنزيمات بتحطيم أي جزيء من الدنا DNA الغريب يدخل إلى الخلية البكترية، وتستطيع البكتريا حماية الدنا الخاص بها من الحلمهة بإنزيمات التحديد الموجودة فيها من خلال إضافة جذر الميثيل إلى إحدى (أو كلتا) القواعد الآزوتية (الأدنبن و/ أو السيتوزين) المكونة لموقع التحديد بعملية تسمى عملية المَثيلَة methylation، ويقوم بذلك إنزيم خاص يسمى إنزيم مِتيلاز methylase.

طريقة تسمية إنزيمات التحديد

يشتق اسم إنزيم التحديد من الاسم العلمي للبكتريا الذي استخلص منها؛ إذ يؤخذ الحرف الأول من اسم الجنس، والحرفان التاليان من اسم النوع، والحرف الرابع (إن وجد) يشتق من اسم السلالة أو النمط ويضاف إليه رقم روماني يدل على ترتيب توصيف هذا الإنزيم في السلالة البكترية التي عُزل منها (في حال كانت السلالة تمتلك أكثر من إنزيم تحديد واحد). يمكن أن يحدث على سبيل المثال أن إنزيم Eco RI يُعزل من بكتريا الأشريكية القولونية Escherichia coli
السلالة RY13 RY13) strain(، والإنزيمين HindII, HindIII يستخلصان من بكتريا Haemophilus influenzae، والإنزيم Xho I يستخلص من البكتريا Xanthomonas holcicola.

تصنيف إنزيمات التحديد وخصائصها

تُصنف إنزيمات التحديد ضمن ثلاثة صفوف:

إنزيمات النمط الأول أو الصف الأول: تتألف إنزيمات هذا الصف من ثلاث تحت وحدات هي تحت وحدة القطع (R)، وتحت وحدة المثيلة (M) الضرورية لإضافة جذر الميثيل إلى DNA الخلية البكترية لحمايته من الهضم، وتحت الوحدة المتعلقة بموقع التحديد (S) والتي تسهم في التعرف النوعي عليه، وتقوم هذه الإنزيمات بوظيفتين أساسيتين هما: التغيير (المثيلة) والقطع.

تحتاج هذه الإنزيمات إلى وجود شوارد (إيونات) المغنزيوم +2Mg إضافة إلى الأدينوزين ثلاثي الفسفات ATP؛ ومركب الـ S- adenosylmethionine في وسط التفاعل كي تستطيع القيام بعملها. تتمثل الطريقة التي يعمل بها هذا الصف من الإنزيمات بأن يقوم الإنزيم بقطع سلسلة واحدة من سلسلتي جزيئة الـدنا على بعد يراوح بين 1000- 5000 نوكليوتيد من موقع التحديد، منتجة بذلك فجوة بطول 75 نوكليوتيداً، ويتم استكمال عملية القطع على السلسلة الثانية باستخدام جزيء ثانٍ من إنزيم التحديد، وإذا كان موقع التحديد غير مُمثيَل (خالياً من جذر المثيل) على إحدى سلسلتي الـدنا فإن الإنزيم يقوم أولاً بعملية المثيلة ثم يقطع سلسلة الـدنا.

فمثلاً: يتعرف الإنزيم Eco B المقطع TGA(N)8TGCT (حيث تمثل N أي نوكليوتيد من النوكليوتيدات الأربعة) ويرتبط معه، ويقطع الـدنا بمسافة تبعد 1000 نوكليوتيد عن موقع التحديد.

طريقة عمل هذا الصف من إنزيمات التحديد هذه تجعلها إنزيمات غير متخصصة بالقطع، لذلك لا يستفاد منها ولا تستخدم بتقانة الدنا المأشوب recombinant DNA technology.

إنزيمات النمط الثاني أو الصف الثاني: تتعرف أغلب إنزيمات هذا النمط مقاطع نوكليوتيدية معينة وتقطع جزيء الدنا ضمنها، ويمكن أن يكون المقطع مكوناً من أربعة أشفاع من النوكليوتيدات أو خمسة أو ستة أو سبعة أو ثمانية. قد يتكون المقطع من جزأين متناظرين بالنسبة إلى محور مركزي وتسمى palindrome؛ أي إنها مقاطع يمكن أن تقرأ بالترتيب نفسه بالاتجاهين المتعاكسين على سلسلتي الـدنا، كما هي الحال بالإنزيم Eco RI، وقد لا يكون المقطع متناظراً كما هو بالإنزيم Hinf I (حيث N تمثل أي نوكليوتيد).

$الوصف: D:\المجلد 3 تقانة اخراج\238\Image475717.jpg$

هناك عدة تحت صفوف تابعة للصف الثاني من الإنزيمات وتتصف أغلبها بامتلاكها لموقع إنزيمي محدد تماماً تقطع ضمنه جزيء الدنا، لذلك يستخدم هذا النوع من إنزيمات التحديد بتقانة الدنا المأشوب.

إنزيمات النمط الثالث أو الصف الثالث: تتألف إنزيمات هذا الصف من تحت وحدتين مميزتين وتحتاج إلى شوارد المغنزيوم +2Mg والأدينوزين ثلاثي الفسفات ATP كي تقوم بعملها، إضافة إلى ذلك تحتاج هذه الإنزيمات إلى مركب الـ S- adenosylmethionine للقيام بعملية التحفيز والتنشيط فقط. تتعرف هذه الإنزيمات على مقاطع نوكليوتيدية قصيرة غير متناظرة، ترتبط بها وتحرض على عملية قطع الدنا بمسافة تبعد 24 – 26 شفعاً نوكليوتيدياً عن موقع التحديد.

هناك إنزيمات تحديد مستخلصة من أجناس بكترية مختلفة تتعرف على موقع التحديد نفسه وتقطع جزيء الدنا في المكان نفسه معطية بذلك نهايات متماثلة وتسمى بالإيزوشيزومير isoschizomers، وتختلف هذه الإنزيمات بعضها عن بعض بالظروف المناسبة لعملها وبثباتيتها، كما هي الحال بالإنزيمين Sac I وSst I، كما أن هناك إنزيمات تتعرف موقع التحديد نفسه ولكنها تقطعه بمناطق مختلفة معطية بذلك نهايات مختلفة، وتسمى بإنزيمات heteroschizomers، كما هي الحال بالإنزيمين Sma I وXma I (الشكل 2).

الشكل (2) إنزيمات heteroschizomers.

ولكي تعمل إنزيمات التحديد بكفاءة عالية لابد من توفر مجموعة من الظروف الخاصة بكل إنزيم من درجات حرارة ودرجات حموضة، إضافة إلى وجود أنواع معينة من الأملاح وبتركيز محدد في وسط التفاعل. تعمل أغلب إنزيمات التحديد بكفاءتها العظمى عند درجة الحرارة 37سْ، إضافة إلى حالات قليلة تحتاج فيها إنزيمات التحديد إلى درجات حرارة غير مألوفة كي تقوم بنشاطها؛ مثل إنزيم Taq I الذي يعمل بدرجة 65سْ؛ وإنزيم Apa I الذي يقوم بنشاطه الأعظمي عند درجة حرارة 30سْ؛ وإنزيم Bcl I الذي يعمل بدرجة 50سْ.

من أهم التطبيقات لاستخدام إنزيمات التحديد:

- المساهمة بإدخال جين ما إلى النواقل البلازميدية أو غيرها لإجراء عملية التنسيل .cloning

- التمييز بين الأليلات alleles حتى في حال اختلافها بنوكليوتيد واحد (إذا كان النوكليوتيد المختلف يقع ضمن مقطع التحديد).

- توصيف الجينات من خلال رسم خرائطها الإنزيمية.

مراجع للاستزادة:

- G. Kahl, Dictionary of Gene Technology, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1995.

- N. E. Murray, Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle), Microbiol., Mol. Biol. Rev. 64 (2), 2000.

- D. N. Rao, S. Sistla, S-Adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzymes, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39 (1), 2004.

- David W. Russell, Joseph Sambrook, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

- R. J. Williams, Restriction endonucleases: classification, properties, and applications, Mol. Biotechnol. 23 (3), 2003 .