البلاسميدات

بحث متقدم

أ ب ت ث ج ح خ د ذ ر ز س ش ص ض ط ظ ع غ ف ق ك ل م ن هـ و ي

البلاسميدات

بلاسميدات

Plasmids -

البلاسميدات

غسان عياش

عزل البلاسميدات

أنواع البلاسميدات

استعمالات البلاسميدات

بلاسميد الإخصاب F

قدم العالم ليدربرغ Joshua Lederberg مصطلح البلاسميد plasmid أول مرة عام 1952، ووُصفت البلاسميدات بأنها تكرارات replications حلقية الأشكال لجزيئات الدنا DNA مستقلة خارج صبغية، ذاتية التناسخ أو التضاعف self replication، تُصادف طبيعياً داخل بلاسما (هيولى) العديد من أنواع البكتريا في بدائيات النواة prokaryotes (الشكل 1)، تنتقل من خلية إلى أخرى في أثناء الاقتران، وتستعمل في تنظيم فعاليات الخلية، وقد توجد في بعض حقيقيات النواة eukaryotes مثل: خميرة البيرة Saccharomyces cerevisiae من الفطريات الزقية وحيدة الخلية اللاثمرية. وبوجه عام يمكن الاستغناء عن البلاسميدات كونها غير ضرورية للخلية فيما يخص الانقسام والنمو.

الشكل (1): أ- الخلية البكترية والبلاسميد فيها.
ب- صورة بالمجهر الإلكتروني للبلاسميد.

المليون (Kbp 1000)، وهذا يكفي لتشفير ما يزيد على 100 جين، أي ما يعادل 1-3% من كامل المَجين (الجينوم) genome البكتري الذي يتضمن آلاف الجينات.

يتفاوت عدد نسخ البلاسميدات المتماثلة في الخلية البكترية من واحد إلى عشرات (الشكل 2)، وقد يصل العدد إلى الآلاف في البلاسميدات الاصطناعية. تشير الأبحاث إلى أن عدد نسخ البلاسميد الواحد في البكتريا الموجبة الغرام أقل بكثير من عددها في البكتريا السالبة الغرام، وذلك بسبب اختلاف تركيب الغلاف ونوع البلاسميد، الأمر الذي يؤثر في كفاءة البكتريا الموجبة ويسهل عملية عزل البلاسميدات منها، وقد تختفي البلاسميدات نهائياً من بعض الأنواع نظراً لوقف تناسخها ضمن خلية المضيف، إما لأسباب داخلية ذاتية وإما بتأثير بعض المواد الكيميائية، ومع استمرار انقسام البكتريا وتكاثرها تتشكل نماذج منها خالية تماماً من البلاسميدات.

الشكل (2) تعدد البلاسميدات في الخلية البكترية.

عزل البلاسميدات

يُعتقد بأن البلاسميدات شظايا حلقية تشكلت من تقطع الصبغي الحلقي الأصلي للبكتريا. ويتم عزلها من الخلية البكترية بطرائق عديدة تتضمن غالباً ثلاث مراحل رئيسة:

مرحلة تنمية البكتريا ضمن مزارع خاصة، حيث تتكاثر فيها لتشكل مستعمرات تحتوي الآلاف من البكتريا، وفي كل منها نسخ كثيرة من البلاسميدات.
مرحلة تجميع الخلايا البكترية بالتثفيل أو بالطرد المركزي للوسط الزرعي السائل، ومن ثم حلها بمذيبات عضوية مناسبة، أو باستعمال الحرارة بهدف تحرير البلاسميدات من البكتريا. ولا بد في هذه الحالة من أخذ الحيطة لدى تحرر البلاسميدات الكبيرة (من قياس يزيد على 10 kbp) كيلا تتحطم جزيئات الدنا العائدة لها.
مرحلة تنقية دنا البلاسميد، كي يصبح جاهزاً لاستعماله ناقلاً جيداً في التقنيات الحيوية وأبحاث الهندسة الوراثية.

أنواع البلاسميدات

يتفق معظم الباحثين على وضع البلاسميدات في خمسة أنواع موزعة على مجموعتين تبعاً لنوعية الجينات التي تتضمنها، وبحسب وظائفها ودورها في الهندسة الوراثية.

تشمل المجموعة الأولى من البلاسميدات:

1- تلك التي لها صلة باقتران البكتريا، وهي بلاسميدات الإخصاب fertility أو بلاسميدات (F) F plasmids.

2- تلك التي لها صلة بالمناعة وتحمل جينات مقاومة الصادات الحيوية، وهي بلاسميدات المقاومة resistance أو بلاسميدات (R) R plasmids.

3- بلاسميدات ذات صلة بإنتاج الكوليسينات colicins المضادة لبكتريا أخرى، مثل: ColE1 في الإشريكية القولونية E. coli وغير ذلك.

تشمل المجموعة الثانية:

1-بلاسميدات التدرك (الهدم) degradation plasmids كالبلاسميد tol الموجود في بعض أنواع جنس الزائِفة Pseudomonas، الذي يحمل جينات تشفر إنزيمات خاصة تسمح للمضيف الذي يحويها بهضم بعض الجزيئات الكيميائية غير الاعتيادية مثل: التولوين toluene وحمض الساليسيليك salicylic acid.

2- بلاسميدات الفوعة (المرض) virulence plasmids، كالبلاسميد تي-آي plasmid Ti الموجود في بكتريا الأجرعية المورِمة Agrobacterium tumefaciencs التي تعيش في التربة (الشكل 3)، ثم تدخل إلى بعض الأشجار المثمرة (أو الأعشاب) عن طريق تشققات أو جروح موجودة على جذورها لتحدث أوراماً تاجية crown galls مختلفة الأشكال والأحجام. يفسر سبب تشكل مثل هذه الأورام المرضية في النباتات الراقية بوجود جينات على البلاسميد Ti تشفر إنزيمات (فيتوهرمونات) تزيد من انقسام خلايا المضيف في مكان الإصابة.

الشكل (3) دخول البلاسميد Ti في البكتريا الأجرعية إلى الخلية النباتية وإحداث المرض فيها.

يعتقد بعض الباحثين أن جزيئات الدنا في الصانعات الخضراء chloroplasts، أو في المتقدرات (ميتوكوندريا) mitochondria ما هي إلا بلاسميدات خاصة، حلقية الأشكال، تحمل الجينات، ولها دور محدد في خلايا النباتات الراقية، كما ساد اعتقاد أن بعض الفيروسات الصغيرة ما هي إلا بلاسميدات اكتسبت غلافاً بروتينياً خارجياً فأصبحت فيروسات لها القدرة على العدوى.

استعمالات البلاسميدات

بعد أن تم الحصول على دنا مؤشب DNA recombinant ومنشط وظيفياً في المختبر in vitro عام 1974 انطلقت مرحلة الهندسة الوراثية التي تعتمد اعتماداً رئيساً على استعمال البلاسميدات في تحقيق أهدافها، وذلك من خلال ثلاث خطوات:

1- عزل الجين المرغوب من مصادر متنوعة بوساطة أحد إنزيمات التقييد أو الاقتطاع restriction enzymes.

2- دمج دنا الجين المعزول مع دنا البلاسميد الناقل vector بوساطة إنزيم ربط الدنا DNA ligase.

3- إعادة إدخال البلاسميدات المؤشبة (حاملة الجينات المرغوبة) في بكتريا أو خلايا الخميرة yeast cells، بهدف تضاعفها نتيجة لتكاثر الخلايا الحاضنة، ومن ثم استعمال الجينات المتكاثرة في الأبحاث والتحسين الوراثي وغير ذلك (الشكل 4).

الشكل (4) الحصول على البلاسميدات المؤشبة حاملة الجينات المرغوبة وإكثارها.

من السهل استخلاص البلاسميدات بهدف استعمالها الواسع في مجالات الهندسة الوراثية بوصفها ناقلات للجينات الغريبة foreign genes، ويتم تضاعفها بإحدى طريقتين:
المضاعفة الصارمة أو الشحيحة stringent replication التي تنتج منها نسخ قليلة ومحدودة من البلاسميدات.

المضاعفة المسترخية أو المستريحة relaxed replication، تنتج منها نسخ كثيرة من البلاسميدات تزيد على 200 نسخة في الخلية. وتستطيع بعض البلاسميدات المتضاعفة بهذه الطريقة أن تستمر بنموها حتى بوجود الصاد الحيوي الذي يثبط بناء الدنا وهو الكلورامفينيكول chloramphenicol، وتصل إلى ما يزيد على 2000 نسخة.

تسمح عملية التنسيل cloning الوفير للجينات بوساطة البلاسميدات بإجراء التحليل الكيميائي للدنا، ومن ثم تحديد التعاقب الحقيقي لأشفاع النوكليوتيدات فيها. وقد تمكن العلماء بوساطة هذه الأبحاث وغيرها من رسم أكثر من مئة ألف خريطة للجينات في جينوم الإنسان human genome، وتبين أنه يحتوي على العديد من الجينات الموجودة في كائنات أخرى مثل البكتريا والفأر والثعبان وغيرها. إضافة إلى ذلك يمكن تصنيع جينات بشرية مناسبة انطلاقاً من جينات معروفة تم كشف تعاقب أشفاعها النوكليوتيدية بهدف إدخالها في خلايا الإنسان لعلاج خلل أو مرض وراثي.

يعد البلاسميد pBR322 من البلاسميدات المعروفة جيداً في استعمالات الهندسة الوراثية، نظراً لدوره المهم في عمليات النسخ الجزيئي. يشير الحرف P إلى كلمة بلاسميد، ويشير الحرفان BR إلى الباحثين بوليفار Bolivar ورودريغيز Rodriguez اللذان عزلاه، وتشير الأرقام إلى تصنيف العزلة. يتكون هذا البلاسميد من نحو 4400 شفع نوكليوتيدي وستة مقرَّات للنسخ cloning sites، يحصل عندها القطع الإنزيمي، كما يحمل جينات المقاومة R وخاصة للصادين الحيويين أمبيسيلين ampicillin R وتتراسيكلين tetracycline R.

تؤدي بلاسميدات المقاومة -بأشكالها المختلفة- لدى انضمامها إلى جينوم البكتريا الممرضة دوراً مهماً في فشل الصادات الحيوية بأداء وظائفها المتمثلة بالقضاء على الأمراض البكترية. وعلى سبيل المثال تم عزل بلاسميد pC194 من بكتريا العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus الموجبة الغرام، ويحمل هذا البلاسميد جينات المقاومة تجاه الصادين الحيويينrifampicin وchloramphenicol .

ارتفعت وتيرة الأبحاث والدراسات حول استعمال البلاسميدات في التعديل الوراثي لبعض النباتات بغية الحصول على الأغذية المحورة وراثياً. وقد تحقق ذلك على القمح والذرة وعباد الشمس وفول الصويا وغيرها (الشكل 5).

الشكل (5) التعديل الوراثي بإدخال مورثات مرغوبة إلى النبات بمساهمة البلاسميد Ti.

كما استعملت البلاسميدات في الحصول على بعض الأدوية الهرمونية، كالإنسولين insulin مثلاً، الذي تنتجه جزر لانغرهانس في المعثكلة (البنكرياس). وهكذا تم عزل جين الإنسولين المناسب وربطه مع بلاسميد ناقل، ومن ثم إدخاله إلى بكتريا حاضنة بحيث يتكاثر مع انقسامها لإعطاء ملايين النسخ من جينات الإنسولين المطلوبة. وقد تم الحصول بالطريقة ذاتها على بروتين الإنترفيرون interferon، الذي يستعمل في علاج العديد من الأمراض الفيروسية، وذلك بمساعدة بلاسميد مؤشب عملاق يضم الجين المناسب، والموقع البادئ ATG، والموقع الناهي TAA، وجين المقاومة R، والمحضض (المعزاز) promoter وغيرها (الشكل 6).

الشكل (6) مخطط يوضح طريقة الحصول على بلاسميد الإنترفيرون المؤشب.

تستعِمل الهندسة الوراثية أحياناً ناقلات هجينة ناتجة من دمج بلاسميد وعاثية البكتريا bacteriophage، ويوجد منها نمطان:

- فاغميد fagmid: يتمثل بجزيئة طولها من 4-10 آلاف شفع نوكليوتيدي K. base.

- كاسميد :casmid يتمثل بجزيئة طولها من 35-40 شفعاً نوكليوتيدياً.

بلاسميد الإخصاب F

تم اكتشاف حالات اقتران conjugation جنسي بين نموذجين من الخلايا البكترية: الأولى معطية donor والثانية آخذة recipient. وتشير الدراسات المتنوعة إلى تدخل بلاسميد خاص في تحديد جنس البكتريا يسمى بلاسميد الإخصاب F (الشكل 7)، وبذلك يمكن تمييز ثلاثة أنماط من البكتريا، وهي:

الشكل (7) مخطط يوضح حالات الاقتران بين أنماط البكتريا الآخذة والمعطية ويبدو بلاسميد عامل الإخصاب F كحلقة في بكتريا الأشريكية القولونية E- coli.

- الخلية البكترية F- تمثل البكتريا الآخذة، تفتقد بلاسميد الإخصاب، توصف في مجال الجنس النسبي كخلية مؤنَّثة، يعطى لها الرمز (-).

- الخلية البكترية F+ تمثل البكتريا المعطية، تحمل بلاسميد الإخصاب الذي يوجد مستقلاً بجانب الصبغي الأساسي للبكتريا، توصف كخلية مذكَّرة، يعطى لها الرمز (+).

- الخلية البكترية Hfr تمثل البكتريا المعطية، تحمل بلاسميد الإخصاب الذي يوجد مندمجاً integrated مع صبغي البكتريا، توصف كخلية مذكَّرة، لكنها تعطي تواتراً عالياً من التأشيب high frequency recombination لدى اقترانها مع الخلية البكترية الآخذة F- (الشكل 8).

الشكل (8) مخطط يوضح اندماج بلاسميد عامل الإخصاب F مع صبغي البكتريا F+ ليحولها إلى Hfr.

باقتران البكتريا F- مع البكتريا F+ يدخل بلاسميد الإخصاب F من الخلية المعطية إلى الخلية الآخذة عبر الجسر التزاوجي المتشكل بينهما، ليعطي بالنتيجة خليتين مذكرتين كل منهما معطية F+، وبذلك لا يفيد هذا النمط من الاقتران برسم الخريطة الصبغية للبكتريا لعدم تشكل نتائج عبورية. وعلى النقيض من ذلك لدى اقتران البكتريا الآخذة F- مع البكتريا المعطية من النمط Hfr لن يدخل بلاسميد الإخصاب F عبر الجسر التزاوجي، وإنما تدخل نسخة من صبغي المعطي، حيث يحصل عبور بينه وبين صبغي الآخذ، ومن ثم تتشكل خلايا بكترية مؤشبة تؤدي دوراً رئيساً في رسم الخريطة الصبغية (الشكل 9).

الشكل (9) اقتران بين بكتريا معطية Hfr وبكتريا آخذة F- والحصول على نتائج مؤشبة.

الشكل (10) مساهمة عناصر الإدخال Is3 في تحويل الخلية المعطية F+ إلى الخلية المعطية Hfr.

تتحول الخلية البكترية المعطية F+ إلى الخلية البكترية المعطية Hfr باندماج بلاسميد الإخصاب F مع الصبغي البكتري، وذلك بمساعدة قطع صغيرة من الدنا موجودة على كل منهما تسمى عناصر تتابعات الغرز أو الإدخال Insertion Sequence elements، واختصاراً عناصر IS (الشكل 10) وتوجد خمسة أنماط منها وهي: IS5, IS4, IS3, IS2, IS1. وبتلاقي العنصر IS3 في البلاسميد لمثيله في صبغي البكتريا يتحقق الاندماج بينهما وتتشكل خلية بكترية معطية من النمط Hfr

مراجع للاستزادة:

- غسان عياش، محمد سليمان، مبادئ الانتخاب والتحسين الوراثي النباتي، جامعة دمشق، 2009.

- P. Marques, Plasmid Biology, Delve Publishing 2017.

- B. A. Pierce, Genetics: A Conceptual Approach, 2005.

- M. E. Tolmasky- J. C. Alonso, Plasmids: Biology and Impact in Biotechnology and Discovery, ASM Press; 2015.